Gene Expression Core (GECO)

Il Gene Expression Core (GECO) di BioGeM e’un laboratorio di supporto per studi di identificazione e caratterizzazione dei geni con particolare riguardo ai profili di espressione genica. L’obbiettivo del GECO e’ quello di offrire ai ricercatori competenze scientifiche e tecnologiche per l’esecuzione di progetti di sequenziamento su larga scala, analisi di microsatelliti, microarray con diverse tecnologie, dissezione laser di piccoli campioni di tessuti e interpretazione bioinformatica dei dati prodotti.
Oltre alla normale dotazione da laboratorio, il GECO possiede una serie di apparecchiature altamente tecnologiche per lo svolgimento delle sue attività.
La purificazione di acidi nucleici viene effettuata in automazione con il Biomek FX, un liquid handler in grado di effettuare, per esempio, circa 800 miniprep al giorno. Questo robot viene utilizzato anche per l’allestimento e la purificazione di reazioni di sequenza e di PCR, con un continuo aggiornamento dei protocolli e dei metodi usati.

Le sequenze e i microsatelliti vengono caricati sul sequenziatore automatico MegaBACE 1000 flexi a 96 capillari, in grado di produrre in media circa 500 sequenze o 800 corse di microsatelliti al giorno. I dati prodotti vengono anche editati e analizzati e vengono forniti agli utenti pronti per le analisi successive.

I profili di espressione genica possono essere eseguiti con due approcci tecnologici diversi. Qualsiasi sia l’approccio scelto dagli utenti, i tecnici del GECO hanno acquisito una grande esperienza nella purificazione dell’RNA e nella preparazione delle sonde per le ibridazioni, per garantire la piu’ alta riproducibilità degli esperimenti. Pertanto gli utenti possono fornire al GECO cellule o tessuti nel buffer di lisi, il GECO provvederà all’esecuzione di tutto il protocollo per la produzione delle sonde.

Il GECO è dotato del Sistema Completo Affymetrix 7G di ultima generazione, in grado di analizzare anche i chip 500K per l’analisi degli SNP. Con questo sistema si possono ottenere profili di espressione per numerosi organismi di interesse scientifico tra cui uomo, topo, ratto, lievito, batteri e diversi tipi di piante. È inoltre possibile analizzare chip con regioni genomiche, con SNP o per il resequencing.

Per i ricercatori interessati all’utilizzo di microarray su vetrini prodotti da altri laboratori il GECO ha a disposizione la stazione di ibridazione automatica LSP a 12 posizioni e lo scanner a laser ScanArray Express, dotato di laser per la lettura di Cy3 e Cy5 e con una risoluzione massima di 5 mm.
Per esigenze particolari il GECO può anche produrre microarray su vetrini a partire da librerie amplificate per PCR o oligo commerciali con lo spotter SpotArray 24. In questo caso la produzione e purificazione dei frammenti per PCR viene interamente gestita con l’automazione del Biomek FX.

Di recente il GECO si e’ concentrato sulla messa a punto di un’altra metodologia importante per il BioGeM: la cattura di piccole quantità di cellule da sezioni di tessuti con il Laser Capture Microdissector, la purificazione e amplificazione lineare dell’RNA per ottenere profili di espressione da abbozzi di organi durante lo sviluppo embrionale.

I dati generati con i microarray vengono analizzati per produrre risultati statisticamente validi e con informazioni biologiche associate alle liste di geni identificati. I dati sono sottoposti a una prima normalizzazione effettuata con il software GCOS per i chip Affymetrix e con lo ScanArray Pro per i microarray su vetrini. Successivamente i dati vengono importati in GeneSpring GX 7.3 per le analisi successive. Qui i dati vengono normalizzati con RMA e analizzati con algoritmi statistici per l’analisi della varianza ANOVA. I risultati sono filtrati per variazione (fold change) e p-value, poi classificati per Gene Ontology e raggruppati per andamento trascrizionale con diversi approcci di clustering.

L’impegno del GECO e’ quello di offrire ai ricercatori supporto scientifico e tecnologico altamente specializzato. Pertanto la formazione e l’aggiornamento del personale sono tenuti in alta considerazione. I tecnici del GECO sono stati formati su tutte le tecnologie presenti in laboratorio e sono in grado di mantenere un’alta produttività, garantendo al tempo stesso efficienza e riproducibilità dei risultati. La loro versatilità permette la realizzazione di flussi di lavoro continui qualsiasi sia il progetto da eseguire.

Grazia Mercadante (mercadante@biogem.it) e’ tecnico di laboratorio dal 1996. E’entrata nel BioGeM a novembre del 2000, dopo un’esperienza di circa cinque anni nel gruppo del Dr. D’Urso al CNR. Si occupa prevalentemente del sequenziamento, dell’ibridazione e lettura di microarray su vetrini e di LCM.

Diego Circolo (circolo@biogem.it) e’ tecnico di laboratorio dal 1999. Ha iniziato anche lui nel gruppo del Dr. D’Urso al CNR, passando al BioGeM nel luglio del 2002. Si dedica prevalentemente alla gestione dell’automazione, all’ibridazione e lettura di Chip Affymetrix e alla costruzione di microarray su vetrini.

Pasquale De Luca (deluca@biogem.it) si e’ laureato nel 1992 e ha il Dottorato di Ricerca in Genetica. Dopo diverse esperienze di ricerca maturate all’Università di Napoli, al CNR e all’IEO e’ entrato in BioGeM nel gennaio 2001 avviando l’allestimento e il coordinamento del GECO, formando e seguendo i tecnici e acquisendo gli strumenti per l’interpretazione dei dati generati dagli esperimenti di microarray.